你的注射剂灭菌验证用自含式生物指示剂可能用错了！

  本文讨论注射剂湿热灭菌验证（过度杀灭）中自含式生物指示剂选用时，容易被忽视的一个法规落地衔接问题，并分析讨论其产生的原因和解决办法。

  生物指示剂是一种对特定灭菌程序有确定及稳定耐受性的特殊活微生物制成品，可用于灭菌设备的性能确认，特定物品的灭菌工艺研发、建立、验证，生产的全部过程灭菌效果的监控，也可用于隔离系统和无菌洁净室除菌效果的验证评估等。生物指示剂分为载体型生物指示剂、芽孢悬液生物指示剂、自含式生物指示剂。（参：中国药典2020年版 第四部 9207）

  生物指示剂的主要质量参数包括总芽孢数（N0）、DT值、存活时间、杀灭时间。D值是指将试验微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量（参：中国药典2020年版 第四部 9208）。也即在基础温度下减少一个Log菌数所需的时间。

  每一支热塑性小培养管中含有带细菌孢子的滤纸片和密封的玻璃安瓿。安瓿中装特殊配方的培养基，灭菌后阴性显紫色、阳性显黄色。简单实用，便于追溯管理。

  灭菌验证分两部分内容，一是物理验证，如热穿透、热分布等验证；二是生物验证，即以实际的微生物杀灭情况来验证灭菌程序的适用性。考虑到技术难度、重现性与可追溯性等问题，目前GMP车间使用比较广泛的为自含式生物指示剂。灭菌验证时，将生物指示剂放置于灭菌柜的不同位置，之后取出进行培养，观察颜色变化即可。简单易操作，结果准确可靠。商业化的生物指示剂会给出D值和N0值，其中的N0值即为微生物接种量（初始芽孢数）。

  2021年颁布《化学药品注射剂灭菌和无菌工艺研究及验证指导原则（试行）》[1]

  F（T,Z）——在规定的温度系数（Z值）下，灭菌工艺期望获得的温度T/℃下的等效灭菌时间，min；

  并论述了推荐参数：一般在灭菌验证时，要求灭菌后所有生物指示剂为阴性结果（即全部杀灭），则NT实际能达到10-1~10-2，甚至更低。但是，为增加灭菌保障的安全边际，一般取NT=1，即lgNT=0。以上公示中，当生物指示剂确定后，其DT可确定，灭菌工艺确定后，所期望的灭菌值F（T,Z）可确定，lgNT取0，则可计算N0。特殊情况下，若选取NT＜1计算N0，应提供较为合理说明。

  目前很多注射剂（水针、大输液）企业的灭菌验证（生物）部分普遍采用商业化的自含式生物指示剂，其关键质量指标：D值在1.5~1.8min，孢子量在3.0×106cfu以下。

  当使用A（进口）时，D值为1.84时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.84=106.52≈3.3×106，而实际标示值为2.3×106，显然，实际使用N0值小于理论计算N0值了。

  当使用B（国产）时、D值为1.86时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.86=106.45≈2.8×106，实际标示值为3.0×106，符合标准要求。

  当使用C（国产）时、D值为1.90时，代入式（4），初始孢子量N0应在1012/1.90=106.32≈2.8×106，实际标示值为1.7×106，不符合要求。

  虽然B（国产）符合要求，但是从有效数字的角度，A（进口）和B（国产）的D值均为1.8，代入式（4），N0值应在5.0×106水平，实际都不符合理论数值要求。

  另据多方调研了解，截止目前，国内多数甚至是大型制药企业的注射剂灭菌验证用生物指示剂的使用都存在以上问题：自含式生物指示剂不满足指导原则对于湿热灭菌（过度杀灭）的应用要求。

  2020版药典在灭菌生物指示剂方面做出了重大修订，推出两个新的生物指示剂指导原则，紧跟美国欧盟等药典及协作组织的要求，已然是很大的进步，但以实例来出具要求，过于宽泛。中国药典2020年版 第四部 9207 《灭菌用生物指示剂指导原则》表1如下：

  实例中，湿热灭菌（121℃）给定的D值范围为1.5~3.0min，芽孢数范围在1.0×105~5.0×106；

  另外，其下还给了一段豁免论述：“。。。在湿热灭菌工艺中，生物指示剂的使用是通过生物学的方法来验证其灭菌效果，只要D值足够，即使初始微生物数量低于106，使用生物指示剂仍旧能验证其灭菌效果。。。”

  2021年颁布的注射剂无菌/灭菌验证指导原则对灭菌后残余孢子量提出了具体且严格的要求（NT=1），但药典并未收载该计算公式和参数要求，两者衔接不明确。

  国内试剂企业依药典范围开发了很多自含式生物指示剂，根据药典论述，自含式生物指示剂耐受性（D值）取决于总系统（安瓿管、微孔盖、载菌试纸、培养基等），如何让D值稳定并升高；如何让N0值持久稳定在106以上水平（即提高初始芽孢量和长期稳定性），仍旧需要攻克大量技术难点。

  另外，该指导原则的适合使用的范围为注射剂申请上市和上市后变更，并不包括车间的常规再验证工作。生产企业照本（药典）宣科，将D值和N0值割裂开来理解，各参数在其范围即投入验证使用。新品注册时，也是惯性考虑，并未根据指导原则要求（含附件公式等）评估适用风险，生产和注册要求脱节。

  应充分理解生物指示剂关键质量参数的内在关联，重视指导原则在新品注册或变更研究中的指导作用，及时来更新灭菌用自含式生物指示剂的应用标准、规程。如，采用进口DT在2.0、N0在106以上级别的自含式生物指示剂（参计算结果③）。

  另外，由于D值测定需要较强的技术能力，《灭菌用生物指示剂指导原则》并未强制规定用户必须对生物指示剂进行D值测定[3]。可是，经本文论述来看，D值虽小，即使是误差位代入计算，对初始孢子量的影响都很大，故此，企业有必要根据《生物指示剂耐受性检查法指导原则》建立D值的复核能力，而不能只是复核N0值。

  如果自含式生物指示剂依旧不能适用，可以参照《灭菌用生物指示剂指导原则》自行接种高浓度芽孢混悬液。此时应测定生物指示剂在灭菌液体中的芽孢数和D值。据文献报道[4]，嗜热脂肪地芽孢杆菌（ATCC9753）的芽孢在纯化水、胰酪大豆胨(TSB)液体培养基、5％葡萄糖注射液和碳酸氢钠注射液中的D值分别为3.26、3.61、0.97和2.94min。即在5%葡萄糖注射液中接种时，初始孢子浓度太高，难以实现。

  GMP生产常规再验证中，如果生物指示剂依旧使用图2中的低值试剂，应充分评估其风险并出报告，确定是不是适用。注意，本文只讨论了过度杀灭的情形（F0≥12min），如采用残存概率法灭菌时（F0≥8min），上述图2 中的生物指示剂并非不能使用。

  本文介绍了湿热灭菌用生物指示剂及其关键质量指标（N0、DT）的基本概念和相互关系，并依据指导原则推荐参数，简化公式，推算数据。基于该数据明确目前企业常用的商业化自含式生物指示剂在湿热过度灭菌中运用时，关键质量指标不符合标准要求的问题。简要分析了其产生原因并推荐了一些解决办法。

  D值：在基础温度下减少一个Log菌数所需的时间，就是在一定温度下，将微生物杀灭90％（即下降一个对数单位）所需的时间（min）。D值是微生物的耐热参数，不同的微生物在不同条件下有不同的D值。

  Z值：系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位时，灭菌温度应升高的度数（℃）。

  F0值：在湿热灭菌中，参比温度规定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌为生物指示剂的Z值为10℃，即F0值为一定杀菌温度T下Z值为10℃时所产生的灭菌效率与121℃、Z值为10℃所产生的灭菌效率相同时所相当的时间Min。也就是说F0值是将各种灭菌温度的灭菌效果转换为121℃灭菌的等效值。